Für Studenten und angehende Allergologen oder sonst Interessierte an Labormethoden zur Allergieforschung

 

Autor

Dr. Rüdiger Wahl

Allergie Experte, Forscher und ehem. Mitglied des CIA (Cillegium internationale Allergologicum)

Mit über 40 Jahren Erfahrung auf dem Gebiet der Allergie Forschung

letztes Artikel-Update vom: 19

.01.2021

Nun möchte ich doch in die Protein- und Biochemie etwas einsteigen.

Vertiefend dazu empfehle ich ihnen entsprechende Fachbücher zu lesen.

 

Wie gesagt sind die meisten Allergene Proteine (Eiweissstoffe).

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird eine Proteinbestimmung durchgeführt, überwiegend nach einer modifizierten Lowrymethode nach Bensadoun und Weinstein oder über die sehr einfache dye binding Methode.

Für die Durchführung beider Methoden wird wenigstens ein Fotometer benötigt.

Die Proteinkonzentration sagt aber nichts über die allergene Aktivität eines Allergen/Allergoidextraktes aus.

Dazu muss ein entsprechender EAST (Enzym Allergo Sorbent Test)-Hemmtest durchgeführt werden.

Über den Test kann eine genaue Aussage über die allergene Aktivität des Extrakts getroffen werden.

Im Rahmen der Standardisierung und Charakterisierung von Allergen/Allergoidextrakten stellt der EAST-Hemmtest die wichtigste Methode dar. Er ist relativ einfach in der Durchführung. Zur Durchführung werden nur wenige Materialien benötigt.

Ein Allergenextrakt besteht aus vielen Proteinen mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Die Molekulargewichte werden über die SDS (Sodium Dodecyl Sulfat)-PAGE (Polyacrylamid Gelelektrophorese) bestimmt. Im elektrischen Feld werden dazu die Proteine nach ihren Molekulargewichten aufgetrennt. Durch Vergleich zu einem mit aufgetrennten Markerproteinmolekulargewichtgemisch, kann den Proteinen das entsprechende Molekulargewicht zugeteilt werden.

Auch kann man die Proteine noch ihren isoelektrischen Punkte über die IEF (Isoelektrische Fokussierung) charakterisieren. Doch die IEF hat im Rahmen der Standardisierung und Charakterisierung von Allergenextrakten längst nicht die Aussagkraft wie die SDS-PAGE.

Die SDS-PAGE stellt auch die Grundlage zum Westernblot dar. Ganz kurz, nach Durchführung der SDS-PAGE erfolgt eine Inkubation mit einem entsprechenden Allergikerserum, z.B. Auftrennung eines Gräserpollenextrakts, Einsatz Gräserpollenallergikerseren im Westernblot. Deren spezifische IgE Antikörper binden sich  an die Proteine, die auch Allergene sind. So kann man mit einer relativ einfachen Technologie feststellen welche Proteine auch Allergene sind, die für den Patienten relevant sind. Denn nicht immer sind die Proteine eines Allergenextrakts auch Allergene.

Der Westernblot spielt eine große Rolle zur Bestimmung von Haupt-, Intermediär- und Minorallergenen in Allergenextrakten.

Beispiel:

Ein Hausstaubmilben Dermatophagoides pteronyssinus Allergenextrakt wird im elektrischen Feld nach seinen Molekulargewichten aufgetrennt. Dann erfolgt eine Inkubation mit wenigstens 10 entsprechenden Allergikerseren. Über weitere Schritte kann dann festgestellt werden welche der Proteine Haupt- Intermediär- und Minorallergene sind. Hauptallergen heißt das >/50% der Allergiker auf das entsprechende Allergen sensibilisiert sind, 25-50% = Intermediärallergen, <25%= Minorallergen. Es wird so ein Allergogramm erstellt.

So ist von der Birke Bet v1 als Hauptallergen bekannt. Durch Verwendung eines sogenannten sandwich ELISAs unter Einsatz monoklonaler Antikörper kann dieses Allergen in dem Gesamtbirkenpollenallergenextrakt quantifiziert werden. Es kann gesagt werden, die Konzentration von Bet v1 beträgt…µg im Extrakt. Das ist eine wichtige Information zur Standardisierung dieses Birkenpollenallergenextrakts.

Das stellt die neueste Methode zur Standardisierung und Charakterisierung von Allergenextrakten dar.

All die Methoden die hier aufgeschrieben, sind alles Labormethoden. Zur Durchführung wird ein entsprechend ausgerüstetes Labor benötigt, die entsprechenden Materialien und Gerätschaften.

Häufig handelt es sich um Methoden, die in der Proteinchemie eingesetzt werden und den Fragen der Allergie angepasst werden. Proteinchemiker werden sich schnell in der Allergieforschung auf laborbasis da zurechtfinden.

Zu vielen Fragen zur Allergie, auch aus Laborsicht, hat das Paul Ehrlich Institut sehr hilfreiche Bücher herausgegeben, die ich nur als weiterführende Literatur empfehlen kann.

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